大球盖菇液体菌种制备技术要点_产业资讯_食用菌新闻_中国食用菌商务网

  碳素营养以葡萄糖最好，依次为蔗糖、淀粉、纤维素、木质素。氮素营养可吸收利用氨基酸，不能直接吸收利用蛋白质、硝酸氮。所需矿质元素包括钙、磷、钾、铁、铜等。温度是控制大球盖菇菌丝生长的一个重要的因子。菌丝体生长温度范围为5℃-3 0℃，最适温度为23℃-28℃。水分是大球盖菇菌丝及子实体生长必不可少的因子。基质中含水量的高低与菌丝的生长及长菇量有直接的关系，菌丝在基质含水量65%-80%的情况异常生长，最适含水量为70%-75%。大球盖菇在pH值为4.5-9均能生长，但以pH值为5-7的微酸性环境较适宜。在pH值较高的培养基中，前期菌丝生长缓慢，但在菌丝新陈代谢的过程中，会产生有机酸，而使培养基中的pH值下降，pH值为6左右时，大球盖菇菌丝生长最快。大球盖菇属于好气性真菌，在菌丝生长阶段，对通气要求不敏感，空气中的二氧化碳浓度可达0.5%-1%。母种-抽滤瓶液体菌种-发酵罐培养料制备-发酵罐灭菌-接种-培养-检测-生产接种。2.复壮培养基配方。土豆20%，琼脂2%，葡萄糖2%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸镁0.15%，水1000ml。3.培养基制备。先将土豆洗净去皮,再称取200g切成1cm左右小块，加水煮沸20min-30min，能被玻璃棒戳破即可，用8层纱布过滤，继续加热，边加入琼脂边搅拌混匀，再加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁，溶解后补足水分至1000ml，分装试管，加塞、包扎，高压灭菌锅灭菌121℃30min，取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。4.接种培养。在无菌条件下取母种尖端菌丝，并用接种钩将菌丝接入试管培养基中部，置于培养箱中25℃黑暗培养。1.生产配方。豆粕粉4g，玉米粉3g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，净化水1000ml。2.培养基制备。称量上面所有原料，要求每瓶分别称量，主要防止各瓶营养的东西不均衡。每瓶2500mL抽滤瓶，将上面原料全部加入，滴一滴消泡剂，一个搅拌子，一片VB1。塞上硅胶塞，用一次性口罩2个交叉盖严硅胶塞及瓶口，用橡皮筋扎紧，因卧式灭菌器灭菌后会在高压条件下自动排汽，防止硅胶塞跳出，需要用细铁丝拧紧瓶口。3.灭菌。将抽滤瓶竖直放入灭菌器，121℃灭菌45分钟，灭菌器排汽降温后，灭菌室压力归零及时将抽滤瓶取出，因灭菌时间多加了15分钟，闷锅时间过长会损失过多营养的东西。放置室温无菌环境下冷却至28℃，再放入超净工作台内。4.接种。将抽滤瓶、酒精灯、接种钩、两把镊子、75%酒精棉、75%小酒精喷壶、生产用母种放入超净，母种远离紫外线灯一侧，盖上一次性口罩，开启紫外线分钟。然后开启风机，关掉紫外线灯，打开照明灯，戴上一次性橡胶手套，酒精消毒手及手臂、工作台接接钩、抽滤瓶。点燃酒精灯，灼烧接种钩放至一侧镊子上备用，将抽滤瓶去掉一次性口罩，用火焰围绕瓶囗灼烧灭菌(可拿酒精灯或使用提前镊子夹少许酒精棉点燃灼烧)，用接种钩将母种在火焰保护下按压挤碎，取小指甲盖大小一撮菌种，一手拿接种钩，一手打开抽滤瓶瓶塞，放入菌种后迅速塞上瓶塞，盖上一次性口罩。5.培养。抽滤瓶放入全温摇床上25℃，150r/mⅰn，培养4天，将有豆粒大小菌球出现，放到磁力搅拌器上打碎菌球，以增加萌发点。24小时后再放至全温摇床内培养两天，然后取出放至磁力搅拌器上，控制好搅拌子转速，防菌液溅到瓶身上部。此时要确定菌球大小基本都在黄豆粒大以下为好，菌球总量占总体积4/5为宜。1.发酵罐清洗。要求罐体内外各个角落都清理洗涤干净，不允许有一点污渍，要上开盖，下开闸，保持罐体干燥备用，不进行空消。2.发酵料配方。按每升豆粕粉8g，玉米粉5g，豆粉3g，红糖15g，葡萄糖5g，磷酸二氢钾0.2g，硫酸镁0.1g。3.预加水升温。加水至夹层焊线位置，提前开启蒸汽发生器，0.6MP压力备用，将蒸汽管路中的冷凝水先排入下水管，然后再打开波纹管连接蒸汽管路的阀门，开启发酵罐下面进蒸汽阀门进蒸汽灭菌，当蒸汽遇冷水会产生振爆，可适当开启气源阀门通入空气减小振爆现象，即减小噪音，又防止设备损坏，同时在通气条件下还能搅拌发酵罐内的水，能不用达到50℃再添料，有很大效果预防料粘罐底情况。4.投料定容。将培养料加水均匀搅拌，倒入发酵罐内，添加消泡剂致培养液上面气泡90%以上消失(约250ml)，补水至上观察口下沿处，擦净罐囗内外，盖好发酵罐盖，对角均匀旋紧螺丝。5.灭菌。发酵罐内培养液升至95℃前，需要提前安装上降温、排水波纹管，同时确定好夹层加热棒断电，夹层无水。95℃以上振爆不明显后关掉进气气源阀门，当温度升至121℃计时，温度别超过125℃，保持温度121℃-125℃90分钟。6.冷却。灭菌时间结束后，先关掉罐底阀门，再关蒸汽管路上阀门，再关蒸汽发生器，不可反向操作，防培养液倒流污染。开启气源阀门通气，当气压超过0.15Mp时，打开夹层进冷水阀门，夹层上囗排水阀门要常开的，或者不安装，接种口阀门关掉，排气阀门要常开，防止误关造成设备损坏。接通加热棒电源，设置到24℃启动，26℃停止。7.接种工具准备。首先，关阀空调、正压风机等造成接种室内空气流动加速的设备，室内酒精消毒，如果有紫外线分钟。随后关紫外线灯，接种要戴一次性橡胶手套，准备抽滤瓶菌种、火焰架、95%酒精棉、两个接种用梯子、半桶干净的水、75%酒精棉及喷壶、灭火用小钢盆或湿毛巾、火机。8.接种。用75%酒精棉擦拭接种囗围边及接种囗，安装火焰架，点燃酒精棉在火焰保护下把抽滤瓶接管与接种口对接，将排气囗排气管前端单向阀取下，把排气管放入水桶中，关掉气源进气阀门。当罐内压力归零后，打开接种口阀门，将抽滤瓶菌种通过接种管送入发酵罐，抽滤瓶内留少量菌种做镜检、平皿划线.培养。开启气源阀门，当气压升至0.01MP时关闭接种口阀门，拔掉接种管，用酒精喷壶清理接种口，安装上排气管前端单向阀，调整罐内压力0.05-0.1MP培养。贴好品种、接种时间标签。24-26℃培养7-10天就可以使用。（1）日常检测：每天要检查发酵罐排出的气味、菌球、菌丝形态及浓度变化、设备工作情况等，确保正常培养过程，4天后可取样本检验测试。（2）发酵罐菌种取样本检验测试：火焰保护下在取样口取灭菌后的空瓶，装约300m l液体菌种。将检测培养基2瓶，PDA培养基平皿2个；灭菌后待接菌料袋2袋及待测液体菌种放入超净工作台，紫外线m倒入检测培养基中置于37℃避光条件下培养24-48小时观察是不是有细菌菌膜，用接种铲粘液体菌种在PDA培养基平皿上划四条线小时观察菌丝是否萌发，装液体菌种20ml均匀倒入料袋中置于28℃避光条件下培养12-24小时观察菌丝是否萌发。（3）显微镜检测：用接种钩另一端直铁丝处粘一滴液体菌种滴到载玻片上，盖上盖玻片制成标本，800倍下观察菌丝有无锁状联合，有锁状联合可正常使用。11.液体菌种品质衡量准则。 大球盖菇液体菌种整个培养过程中果香味，无异味；菌球均匀无破裂，菌球占比80%以上；取样本检验测试无污染，菌球萌发时间短，菌丝粗壮 ；镜检锁状联合明显。1.母种。日常生产时，将母种置于冰箱4℃贮藏即可，如贮藏时间不超过3个月，使用时可取出后活化1-2天直接用来生产使用。2.抽滤瓶液体菌种。可临时置于冰箱4℃贮藏，为保障菌球活性，贮藏时间不超过15天为宜。3.发酵罐液体菌种。培养7-10天后，如无法及时生产使用，可将培养温度调低至20℃，同时减少发酵罐通气量，以减缓菌丝生长速度。但整个培养周期不宜超过20天。（作者：山东莒县政务服务中心赵君法，莒县农业技术服务中心门庆永 武辰阳李爱科 姚红燕）

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